Røde flekker og overgang til svarte flekker i laksefilet

Prosjektet vil bli gjennomført ved bruk av materiale tilgjengelig fra det tidligere prosjektet “Avklaring av PRV-viruset sin rolle i utvikling av røde og mørke flekker i laksefilét”​ (FHF-901221, der utviklingen av røde og svarte flekker i en populasjon ble fulgt fra sjøutsett til slakt, og der det ble gjennomført 7 uttak i denne perioden der minst 600 fisk ble undersøkt hver gang og materiale ble samlet inn. Supplerende materiale kan om ønskelig bli samlet inn i prosjektperioden. Det foregående prosjektet (FHF-901221) viste at prevalensen av røde flekker er konstant og uavhengig av PRV-status, mens svarte flekker kan variere i alvorlighetsgrad avhengig av PRV-status. Prosjektet vil ta for seg dette materialet og undersøke det i detalj med henblikk på patologiske prosesser i røde flekker som kan bidra til å forstå hvorfor de oppstår samt hvordan de utvikler seg fra røde til svarte flekker. Infeksjonsstatus i vev og særlig i muskelceller vil bli analysert med forskjellige metoder (in situ hybridisering, immunhistokjemi og elektronmikroskopi).

Videre har det vært spekulert i om ribbensbrudd kan gi opphav til røde flekker. Prosjektet tar sikte på å håndfiletere 1000 fisk for å beholde benstrukturene intakte og undersøke funn av røde og svarte flekker i denne fisken med avanserte røntgenteknikker (røntgenavdelingen ved NMBU Veterinærhøgskolen).

Videre vil det undersøkes om eksperimentell vaksinering mot PRV, som er vist å redusere virusmengden i fisken og beskytte mot HSMB, kan gi en reduksjon i forekomsten av svarte flekker.

Arbeidspakke 1
Ansvarlig: Erling Olaf Koppang ved NMBU Veterinærhøgskolen.
I denne arbeidspakken inngår en omfattende undersøkelse av røde og svarte flekker med forskjellige morfologiske analyser og transkripsjonsanalyser. Det blir sentralt å utføre in situ hybridisering for å påvise og karakterisere ulike vevsreaksjoner for å avdekke mekanismer bak dannelsen av røde og svarte flekker. Videre vil det benyttes elektronmikroskopi. 

I en del av denne arbeidspakken vil det også på et så tidlig tidspunkt som mulig bli gjennomført undersøkelser for å avdekke om ribbensbrudd kan gi opphav til røde flekker. Dette vil bli gjort i samarbeid med et nærmere bestemt oppdrettsfirma​. Videre er det avtalt samarbeide med røntgenavdelingen ved NMBU Veterinærhøgskolen ved førsteamanuensis Hege Skogmo Kippernes. 

Arbeidspakke 2
Ansvarlig: Espen Rimstad ved NMBU Veterinærhøgskolen.

Denne arbeidspakken vil se nærmere på PRV sin betydning for utvikling av svarte flekker samt hvordan infeksjonen påvirker celler og hvilke celler som infiseres. I første omgang vil man etablere in situ hybridisering for PRV-deteksjon i laboratoriet. Det er inngått samarbeid med en gruppe ved Department of Fisheries and Oceans, BC, Canada, som har metoden etablert for PRV. Stipendiat Dhamotharan Kannimuthu, som lønnes av et annet prosjekt, vil være sentral for å få metoden etablert. I samarbeid med den canadiske gruppen vil metoden utvides til å kunne påvise cellulære inflammatoriske responser. Det vil fortløpende evalueres om det er hensiktsmessig med korttidsopphold i BC, Canada eller vice versa, for å få prosessen til å gå raskt.

I samarbeid med Norges forskningsråd-prosjektet "Comparing the protection of attenuated and inactivated virus vaccines against pancreas disease and heart and skeletal muscle inflammation (ViVaAct)" (forskningsrådets prosjektnr. 280847​) som ledes av Rimstad, vil man undersøke om vaksinering mot PRV kan ha beskyttende effekt mot utvikling av melaninflekker.​

En teori for opphavet til røde flekker er at de kan været forårsaket av ribbensbrudd. Prosjetkgruppen har undersøkt dette inngående og er i ferd med å ferdigstille en artikkel om dette. Her blir konklusjonen at ribbensbrudd er en mulig årsak til røde flekker, men at det i tillegg finnes andre faktorer som kan indusere røde flekker. Dette er i tråd med det som er beskrevet ovenfor: En mekanisk skade uten fremmedelementer igangsetter først og fremst vevsreparasjon og i mindre grad betennelsesreaksjoner. Det er aldri brudd uten blødning. Det finne altså flere faktorer som gir blødninger (røde flekker). Videre er det heller ikke bevist at de røde flekkene i fisk med brudd oppstår som følge av bruddet, men det er sannsynlig.
 
Arbeidspakke 2: Identifisere eventuelle tromber i flekker 
Mikroskopiske undersøkelser av fisk med røde flekker har gitt to funn som prosjektgruppen så langt ikke har klart å sette i sammenheng med andre faktorer: I noen røde flekker finnes det rikelig med blødninger. I andre finnes det ikke blødninger, derimot massiv død (nekrose) av muskelfibre. Disse forandringene fremstår også som røde, men rødfargen skyldes sannsynligvis ikke blødninger, men muskelnekrose. Dette er et funn som indikerer at det kan være flere årsaker til røde flekker. Vi vet heller ikke om alle røde flekker utvikles til svarte eller om reparasjonsprosessene fjerner de før de kommer så langt.

For å undersøke dette nærmere har vi i samarbeid med Bremnes Seashore samlet inn et betydelig materiale for å undersøke for trombedannelser i karene. Slike trombedannelser kunne forklare ekstensiv muskeldød på grunn av mangel på blodtilførsel nedstrøms for tromben. Tromber kan være av ulik karakter, for eksempel kan den dannes av fett i blodet eller den kan oppstå som følge av karskade med påfølgende trombedannelse av blodet. I det innsamlede materiale har vi funnet et fåtall tromber. Imidlertid viser det seg at slike tromber antakeligvis er svært lokale, og det kan by på store problemer å finne dem på histologiske snitt. For å kunne finne dem, må det lages histologiske snitt i mange plan gjennom en vevsprøve, kanskje så mange som 50–100 med en del mellomrom mellom for å lete etter tromben. Dette er en kostbar og arbeidskrevende oppgave som prosjektgruppen i det videre ønsker å gå systematisk til verks med.
 
Arbeidspakke 3: Karakterisere årsaker til celledød i flekkene 
Celler vil kunne programmeres til å dø ved enten apoptose eller nekroptose dersom de stresses som en følge av infeksjoner, fremmedstoffer o.l. Apoptose er ikke betennelsesdrivende, mens nekroptose er betennelsesdrivende. Prosjektgruppen evaluerer, ved hjelp av in situ hybridisering, om den finner disse typene programmert celledød i røde- og i røde/svarte overgangsflekker. Dersom det foreligger en skade som ved akutt ischemi (oksygenmangel), ved for eksempel trombedannelse, forventer det ikke å kunne påvise utbredt programmert celledød, altså verken apoptose eller nekroptose. Dette er altså en indirekte måte som kan forklare hvorfor cellene dør og som dermed kan gi en pekepinn på hva som forårsaker dette.
 
Arbeidspakke 4: Genetisk karakterisering av PRV i røde flekker
Prosjektgruppen vet at det er forskjellige genetiske varianter av PRV-1 og disse har ulik virulens med hensyn til å kunne gi HSMB (H. Bjørgen et al., 2020), og vi vet at de genetiske PRV-1 variantene i som har høyest virulens til å gi HSMB dukket opp i norsk oppdrett rett før år 2000 (M. S. Malik et al., 2019). Man kan tenke seg at ulike varianter av PRV-1 har ulik evne til å assosiere med flekkdannelse. Det er ikke publisert at det er en statistisk korrelasjon mellom forekomst av HSMB og flekker, men årsaken flekkene som observeres ved slakt kan ligge langt tilbake i tid. Det er dog nevnt (anekdotisk) at forutgående SAV eller PRV infeksjoner, som begge kan gi betennelse i muskulatur, er assosiert med økt prevalens av flekker. Prosjektgruppen ønsker å videreføre dette arbeidet.

Prosjektgruppen har funnet at flekkene kan dannes med og uten PRV, men at de er alvorligere i gruppen av PRV-positiv fisk. Men, all fisken på Svåsand ble over tid PRV-positiv, og prosjektgruppen har ingen negativ kontroll, det vil si PRV-negativ slaktemoden fisk. En ønsker derfor å screene populasjoner av fisk for forekomst av PRV, noe som kan gjøres for eksempel i forbindelse med uttak av prøver for SAV. I Nord-Norge er det ikke SAV og fisken prøvetas derfor gjennom hele produksjonsperioden. Gitt at prosjektet finner en PRV-negativ populasjon, vil man undersøke den og ta ut prøver i forbindelse med slakting. Helt spesifikt vil prosjektgruppen karakterisere flekkene i PRV-negativ slaktefisk mot dem man fant i PRV-positiv slaktefisk fra Svåsand.
 
Arbeidspakke 5: Karakterisering av kranioventral bukmuskulatur
En populasjon går i kar inne, og en matchende populasjon ute i merd. Det er allerede etablert kontakt med Matre forskningsstasjon, Havforskningsinstituttet og prosjektet har muligheter for å hente prøver fra populasjoner av laks hvor den eneste forskjellen er at en populasjon går i en tradisjonell merd i sjø, mens matchende populasjon går i kar inne.

Dersom dette peker i retning av at bukmuskulaturens styrke og kapillærkarenes kvalitet er sentrale for kranioventrale flekker kan det for eksempel gjøres forsøk i mindre merder hvor strøm/sirkulasjon brukes i vannet.
 

Arbeidspakke 6: RNA sekvensering for røde flekker og muskulatur
Det vil gi en detaljert beskrivelse av betennelsesreaksjonene og eventuelt avdekke et eller annet ukjent som prosjektgruppen har oversett. Det er etablert et samarbeid med Torstein Tengs, Nofima om utføring og tolkingen av RNA-sekvenserte analyser.

I samarbeid med Rikshospitalet holder prosjektgruppen på med RNA-sekvensert analyse av laksecellelinjen SHK-1, som opprinnelig ble anlagt for å kunne dyrke ILA-virus. Denne cellelinjen har man tidligere vist kan produsere melanin. Dette vil kunne gi informasjon som er spesifikk for melaninproduserende celler og celler som er i overgangsfase til å kunne bli melaninproduserende. Denne informasjonen kan være nyttig i den pågående karakterisering av melaninproduserende celler i flekker.
 
Arbeidspakke 7: Karakterisering av skader av endotel i flekker
Noe gir betennelse i den kranioventrale muskulaturen. Prosjektgruppen tolker de samlede funn dit hen at en mangelfull bruk av denne muskulaturen kan være medvirkende. Dersom dette skylder skader i endotelcellene, vil lekkasje av blod fra blodkar være sekundær. En karakterisering av endotelcellene i dette området versus andre områder i fisken vil også være informativt.